ABSTRACT
Resumen En el presente estudio se describe un flujo de trabajo que puede ser aplicado a diferentes especies vegetales, con el fin de obtener extractos apoplásticos que puedan ser usados para análisis proteómicos. Para ello, usando tallos y raíces de clavel, se evaluaron parámetros claves para la extracción de estas proteínas. Se determinó que para esta especie (Dianthus caryophyllus L.) se debe usar la solución amortiguadora fosfato de sodio 0,1 M pH 6,5, cloruro de sodio 50 mM y 0,1% β-mercaptoetanol para la infiltración; con tres tiempos de vacío de 20 s a 70 kPa y centrifugación a 1000 x g durante 20 min a 4 °C, seguido de precipitación y concentración de proteínas con el método Ácido tricloroacético/acetona. Bajo estas condiciones, se obtienen extractos que permiten análisis electroforéticos en 2D de proteínas de apoplasto, usando para el isolectroenfoque tiras con gradientes de pH 5-8 para raíz y pH 3-10 para tallo. Las condiciones descritas permitirán profundizar sobre el papel de las proteínas apoplásticas en diversidad de fenómenos biológicos que involucren esta especie vegetal.
Abstract In the present study a workflow, that can be applied to different plant species, to obtain a high quality apoplastic extract and for proteomic analysis is described. For that, using carnation roots and stems, some important parameters for the extraction of these proteins were evaluated. The best conditions for the infiltration were provided by using a 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.5, 50 mM sodium chloride and β -mercaptoethanol 0.1%, with 3 vacuum times at 70 kPa for 20 s and centrifuged at 4°C at 1,000 g for 20 min, and then a subsequent protein precipitation and concentration with the Trichloroacetic acid/acetone protocol. These conditions can be used to obtain a good quality extract for 2D electrophoretic analysis of apoplastic proteins. Strips with pH gradients between 5-8 and 3-10 were used to run isoelectric analysis for extracts obtained from apoplast in roots and stems, respectively. The conditions described can be used to perform studies focused on apoplastic proteins and its role in biological phenomena involving this plant species.
Resumo No presente estudo, é descrito um fluxo de trabalho que pode ser aplicado a espécies vegetais diferentes, para obter extratos apoplásticos que podem ser utilizados para análise proteômico. Para isto, utilizando os caules e as raízes do cravo, foram avaliados parâmetros considerados chave para a extração destas proteínas. Foi determinado que para esta espécie, deve ser utilizada uma solução tampão de fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5 com cloreto de sódio 50 mM e 0,1% β-mercaptoetanol para a infiltração; com três aplicações de vácuo de 20 s a 70 kPa e centrifugação a 1000 x g por 20 minutos a 4°C, e subsequente precipitação e concentração de proteínas usando Ácido ricloroacético/acetona. Nestas condições se podem obter extratos que permitem a análise eletroforética 2D de proteínas do apoplasto utilizando para a focalização isoeléctrica tiras com gradientes de pH 5-8 para a raiz e de pH 3-10 para o caule. As condições descritas permitirão aprofundar sobre o papel das proteínas apoplásticas numa diversidade de fenômenos biológicos que envolvem esta espécie de planta.
ABSTRACT
Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
ABSTRACT
Se evaluó la actividad enzimática peroxidasa (POD) y el contenido de lignina en tallos de esquejes de clavel (Dianthus cayophyllus L.) inoculados con el hongo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod) raza 2, con el fin de determinar su posible participación en la respuesta de defensa y en la resistencia de la planta al marchitamiento vascular. Inicialmente se seleccionaron las condiciones para la extracción y determinación de la actividad enzimática. Se encontró que el tratamiento con buffer citrato 100 mM pH 5,0 con 3% de PVPP presentó los mejores resultados de actividad peroxidasa para la extracción de la enzima a partir de tallos de clavel. Se determinaron las mejores condiciones para la medida de actividad enzimática POD a través de la reacción de oxidación de o-dianisidina con H2O2 seguida a 460 nm. Una mezcla de reacción con una concentración 0,6 mM de o-dianisidina y 2,0 mM de H2O2 en buffer citrato 100 mM a pH 5,5 y 45°C, presentó los mejores resultados para la cuantificación de la enzima. Una vez establecidas las condiciones, esquejes de clavel de una variedad tolerante y una susceptible al marchitamiento vascular fueron inoculados con el patógeno y se evaluaron los niveles de actividad de POD y de acumulación de lignina a diferentes tiempos pos-inoculación. La variedad tolerante (Bárbara), presentó inducción de dicha enzima a las 8 y 48 h pos-inoculación y aumento en el contenido de lignina a 48 y 72 h. A su vez, en la variedad susceptible (Delphi) no se encontraron cambios significativos en los niveles de POD ni en el contenido de lignina. Se estableció, por tanto, que la inducción de la actividad POD está asociada a la lignificación, que a nivel del tallo, hace parte de los mecanismos asociados a defensa en el modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Peroxidase (POD) enzymatic activity and lignin content in carnation stems (Diant-hus cayophyllus L.) infected with the fungus Fusarium oxysporum f.sp. dianthi race 2 were evaluated with the purpose of determining the possible enzyme participation in the plant defense response and in the resistance to the vascular wilting. Initially, the conditions for extraction and determination of enzymatic activity were selected. It was found that when citrate buffer 100 mM pH 5.0 with 3% PVPP was employed, the results of POD activity in enzyme extract obtained from carnation stems were higher. Best conditions were set for POD activity measure through oxidation reaction of o-dianisidine and H2O2 at 460 nm. A reaction mixture with a concentration of o-dianisidine 0,6mM and H2O2 2.0 mM in citrate buffer 100 mM pH 5.5 at 45 ºC displayed the best results for enzyme quantification. Once conditions were established, tolerant and susceptible vascular wilting carnation cuttings were inoculated with the pathogen. In each treatment at stem level, different postinoculation times were evaluated for enzyme activity levels and lignin accumulation. Tolerant variety (Barbara) showed a POD induction at 8 and 48 h pos-inoculation and an increase in lignin content at 48 and 72 h. At the same time, in susceptible variety (Delphi) there were no significant changes in POD levels or lignin contents. Therefore, it was established that POD activity induction is associated to lignification which, at stem level, is part of the mechanisms associated to defense in carnation (Dianthus caryophyllus L.) against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Foram avaliadas a actividade enzimática peroxidasa (POD) e o conteúdo de lignina em talos de estacas de cravo (Dianthus cayophyllus L.) inoculados com o fungo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2, com o propósito de determinar a sua possível participação na resposta de defensa e à resistência da planta ao murchamento vascular. Inicialmente foram seleccionadas as condiciones para a extracção e determinação da actividade enzimática. Foi encontrado que o tratamento com buffer citrato 100 mM pH 5,0 com 3% de PVPP, apresentou os melhores resultados de actividade peroxidasa na extracção da enzima a partir de talos de cravo. Foram determinadas as melhores condições para medir a actividade enzimática POD a través da reacção de oxidação de o-dianisidi na com H2O2 e com seguimento a 460 nm. Uma mistura de reacção com uma concentração 0,6 mM de o-dianisidina e 2,0 mM de H2O2 em buffer citrato 100 mM a pH 5,5 e 45 °C, apresentou os melhores resultados para a quantificação da enzima. Uma vez estabelecidas as condições, estacas de cravo de uma variedade tolerante e uma susceptível ao murchamento vascular foram inoculadas com o fungo patogénico, e se avaliaram a diferentes tempos pos-inoculação os níveis de actividade desta enzima e de acumulação de lignina. A variedade tolerante (Bárbara), apresentou uma indução de POD às 8 e 48 h pos-inoculação e um aumento no conteúdo de lignina às 48 y 72 h. Por outro lado, na variedade susceptível (Delphi) não se encontraram mudanças significativas nos níveis de POD nem no conteúdo de lignina. Se estabeleceu, por tanto, que a indução da actividade POD está associada à lignificação que a nível de talo faz parte dos mecanismos associados à defesa no modelo cravo-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2.